FAQ

Que sont les vecteurs rétroviraux (RV) ou lentiviraux (LV) ?

A quoi servent les vecteurs retro/lentiviraux ?

Comment sont produits nos vecteurs lentiviraux ?

Comment sont produit nos vecteurs rétroviraux ?

Quelle est la structure du génome du VIH ?

Que sont les RCR et les RCL ?

Quelles sont les méthodes qui permettent de détecter les RCL et RCR ?

Dans quel niveau de confinement dois-je manipuler ces vecteurs ?

 

 

Que sont les vecteurs rétroviraux (RV) ou lentiviraux (LV)?

Les vecteurs rétroviraux (Retroviral vectors, RV) et lentiviraux (Lentiviral vectors, LV) dérivent respectivement des gammaretroviruses et des Lentiviruses. Ces deux virus appartiennent à la même famille, celle des Retroviridae (classe 6). Les RV et LV permettent de délivrer un gène d'intérêt dans un bon nombre de type cellulaire différents. Avec ces outils, votre séquence d'ADN d'intérêt est insérée de manière "stable" dans le génome de la cellule cible. L'introduction d'un gène d'intérêt dans le génome d'une cellules par un virus ou un vecteur viral s'appelle la transduction et les cellules sont alors dites "transduites".  

 

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Nos vecteurs lentiviraux dérivent du génome du lentivirus VIH (HIV-1) et nos RV du virus "Murine leukemia virus" (MuLV).

 

 

A quoi servent les vecteurs retroviraux (RV) et lentiviraux (LV) ?

LV ont la capacité de transduire efficacement un bon nombre de types cellulaires y compris les cellules qui ne se divisent pas. Les RV sont capables de transduire uniquement les cellules qui se divisent car l'intégration du provirus nécessite une dissociation de la membrane nucléaire. Les LV et les RV permettent d'obtenir une expression à long terme du transgène grâce à leur capacité à intégrer leur génome dans celui de la cellule cible. La taille du transgènepeut être relativement grande: 8 kb. La séquence finale intégré, contenant votre gène d'intérêt, ne code pour aucune protéine virale.

 Les RV et LV peuvent être, notamment, utilisés pour les applications suivantes:

  • Introduction de gène d'intérêt dans des cellules difficilement transfectables (comme les neurones), les cellules primaires ou les cellules dont le cycle cellulaire est à l'arrêt.Ce dernier point n'est uniquement valable que pour les LV
  • Integration de votre gène d'intérêt dans le génome des cellules adhérentes ou non 
  • Ce processus de transduction est très reproductible
  • "In vivo imaging": expression concomitante de votre gène d'intérêt et d'un gène rapporteur (par exemple: la luciferase ou l'EGFP).

Comment sont produits nos vecteurs lentiviraux ?

Les vecturs lentiviraux sont produits suite à la transfection transitoire de cellules  HEK293  par des plasmides d'empaquetage ("packaging" contenant les gènes GAG, POL, REV du HIV-1 et une ou des glycoprotéines) et un plasmide de transfert (contenant le gène ou shRNA d'intérêt, le signal d'encapsidation du VIH-1 et les deux LTR du VIH-1).  Afin de produire des particules lentivirales, plusieurs fonctions d'empaquetage sont nécessaires: 

  • GAG + POL: le produits enzymatique codé par le gène POL et les protéines de structure provenant du gène GAG permettent de générer des capsides virales vides qui pourront alors acquérir une enveloppe par la suite. Dans cette enveloppe seront enchassées les glycoprotéines (provenant d'un autre plasmide; voir Glycoprotéine ci dessous). Après l'assemblage du vecteur viral, toutes ces fonctions vont être utiles pour les premières étapes de l'entrée du vecteur dans la cellules jusqu'à l'intégration du gène d'intérêt dans le génome de la cellules hôte: entrée dans la cellules cible, réverse transcription, translocation nucléaire et intégration. Durant ces étapes, auncune protéine virale ne sera néo-synthétisée et aucun gène viral ne sera intégré dans le génome de la cellule hôte.
  • REV: Cette protéine est uniquement présente dans le génome des lentinvirus et agit comme activateur post-transcriptionnel. Cette protéine est essentielle pour une expression du transgène, elle stimule notamment l'export des ARN viraux non épissés.
  • Glycoprotéines: les glycoprotéines parentales du VIH sont généralement remplacées par des glycoprotéines d'autres virus afin d'étendre le tropisme cellulaire du vecteur viral (on parle alors de pseudotypage). La glycoprotéine la plus fréquement utilisée est la glycoprotéine G du virus de la somatite vésiculaire (vesicular stomatisis virus:VSV-G.

Ainsi, dans le but de générer des particules lentivirales, des cellules HEK293T sont co-transfectées avec:

  • le vecteur de transfert de gène: un plasmide contenant le gène ou shRNA d'intérêt (GI) cloné derrière un promoteur adéquat (P), un gène codant pour un marqueur de sélection et la séquence d'encapsidation (Psi) du VIH. Toutes ces séquences sont comprises entre les deux LTR du VIH.
  • les plasmides auxiliaires codant pour Gag-POL et Rev (notons que ces séquences peuvent se trouver sur des plasmides différent afin de diminuer le risque de recombinaison).
  • le plasmide d'enveloppe:  VSV-G par exemple.

Le surnageant est alors récolté durant 3 jours et déposé sur les cellules cibles pour les transduire. 

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Les surnageants récoltés sont soit directement utilisés (dont le titre est d'environ = 10E6 IU/ml (IU=infectious Unit)) soit concentrés par ultracentrifugation (100-200 x; titre approximatif = 10E8 IU/ml).

La plateforme des vecteurs viraux du GIGA peut vous fournir: 

  •  30 mL de vecteur non concentré ≥10E6 IU/mL
  • 3x100 µL  of vecteur concentré ≥10E8 IU/mL

Mais elle peut aussi transduire vos cellules cibles avec ces vecteurs viraux puis réaliser des tests de détection des RCL (Vecteurs lentiviraux compétents pour la réplication; Replication competent Lentiviruses).

 

Comment sont produit nos vecteurs rétroviraux ?

Les vecteurs rétroviraux peuvent être produits par transfection transitoire des cellules dite de "packaging" avec un plasmide de tranfert.  Ces cellules permettent une expression constitutive de particules virales écotropes (pour la transduction des cellules murines) ou amphotropes (pour étendre le tropisme aux cellules humaines).  Le plasmide de tranfert contient le gène ou shRNA d'intérêt (sous la dépendance du promoteur rétroviral LTR) ainsi que le signal d'encapsidation (Psi).  Le surnageant produit après 48, 72 et 96 heures est alors récolté pour être déposé sur les cellules cibles afin de les transduire et permettre ainsi l'expression du transgène.

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La plateforme des vecteurs viraux du GIGA peut vous fournir: 

  •  40 mL de vecteur non concentré ≥10E6 IU/mL
  • 400 µL de vecteur concentré ≥10E8 IU/mL

Mais elle peut aussi transduire vos cellules cibles avec ces vecteurs viraux puis réaliser des tests de détection des RCL (Vecteurs lentiviraux compétents pour la réplication)

 


Quelle est la structure du génome du VIH ?

La structure du génome duVIH est représentée ci-dessous. Notons que les gènes codant pour les protéines accessoires et régulatrices ne sont pas présentsdans le génome des oncorétrovirus0

Le plasmide de transfert du gène d'intérêt contient:

  • les deux régions LTR (avec une mutation dans la région U3 dans le but d'obtenir des vecteurs auto-inactivants (self-inactivating (SIN) vectors)
  • le signal d'empaquetage: Psi
  • un promoteur adéquat pour l'expression du gène d'intérêt
  • le gène ou shRNA d'intérêt.

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Que sont les RCR et les RCL ?

 

RCR= Replication Competent Retrovirus
RCL= Replication Competent Lentivirus

 

 

Comment cette recombinaison se produit-elle ?

Il peut s'agir d'une recombinaison entre:

    • les plasmides d'empaquetage et de transfert
    • les  plasmides rétro-lentiviraux et de l'ADN cellulaire  (des séquence virales endogènes présentes dans le génome des cellules)
    • les plasmides rétro-lentiviraux et d'autres rétrovirus

 


Quelles sont les méthodes qui permettent de détecter les RCL et RCR ?

  • Détection de l'activité de la transcriptase inverse (RT activity detection: PERT assay (Sastry L.(2005) Mol. Therapy, 11, S321))
  • Détection de l'activité de l'integrase (XpressBio)
  • Détection de l'effet cytopathique dans un type cellulaire spécifique: MLV specifics: test PG-4 S+L-  et  XC (écotrope) 
  • qRT-PCR (clontech; Lenti-X and Retro-X qRT-PCR Titration Kits - ABM; Lentivirus qPCR Titer Kit):
  • ELISA p24 pour VIH (clontech, perkinelmer, sigmaaldrich, Inngenetic NV, XpressBio)
  • ELISA p30 pour MLV (Sujeong K. (2004) J. of Virological Methods; 118, 1) 
  • Test de Mobilisation  / marker rescue assay pour RCR (pour plus d'informations: Satry L. Detection of RCR and lentivirus. (2009)  506, p243-263 )
The GIGA Viral vector platform used qRT-PCR methods for RCR and RCL detection. 

Dans quel niveau de confinement dois-je manipuler ces vecteurs ?

Cet arbre de décision peut vous aider à choisr le niveau de confinement adéquat pour la manipulation de vos vecteurs.Vous pouvez aussi trouver plus d'information sur ce sujet relatif à la Belgique dans l'article suivant: Pauwels, K., R. Gijsbers, et al. (2009). "State-of-the-art lentiviral vectors for research use: risk assessment and biosafety recommendations." Curr Gene Ther 9(6): 459-474 
 
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